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Q&A

2022.08.18

정제 단백질 및 펩타이드의 가수분해

“단백질과 펩타이드”란 바이오리액터 또는 정제 프로세스에서 생성된 비교적 순수한 샘플을 일컫습니다. 이 샘플에는 단백질이 아닌 물질이 거의 또는 전혀 포함되어 있지 않습니다. 인텍프로테인 또는 펩타이드에서 유리 아미노산을 생성하는 것은 유용하고 정확한 아미노산 분석 데이터를 생산하기 위해 대단히 중요한 단계입니다. 이를 위해서는 단백질/펩타이드를 개별 아미노산 성분으로 분해하거나 가수분해해야 합니다.

이번 섹션에서는 증기상과 액체상의 단백질과 펩타이드를 가수분해하는 절차를 설명합니다. 아울러 최적 분석을 위해 미리 고려해야 하는 사항을 중점 설명합니다.

또한 추가 서브섹션을 통해 표준 산성(HCl) 가수분해 기법과 호환되지 않는 아미노산, 즉 트립토판과 시스테인/시스틴이 들어 있는 특수 샘플을 가수분해하는 절차를 설명합니다.

2.1 단백질의 산성 가수분해
이 섹션에서는 아미노산 샘플을 전처리할 때 가장 많이 사용되는 HCl을 이용한 산성 가수분해에 대해 설명합니다. 단, (어떤 방법으로든) 단백질 샘플을 완벽히 가수분해하기 위해서는 몇 가지 요소를 고려해야 합니다. 절차 추정을 할 때에는 중화용 완충액과 고체 존재 여부를 고려해야 합니다. 또한 단백질 속 아미노산별로 가수분해의 비율이나 범위가 달라지므로 가수분해 프로세스의 경과 시간을 연구하고 전체 Method를 충분히 검증해야 합니다. 가수분해를 할 때 샘플을 적절히 취급하면 고품질의 결과를 얻을 수 있습니다. 이런 유형의 분석에서 문제는 주로 기법이 부적절하거나 허술한 데서 나옵니다. 이 Method로 적절한 가수분해를 진행하기 위해서는 다음 네 가지 질문에 먼저 답해야 합니다.

샘플 희석이 필요한가?
가수분해 튜브에 넣을 샘플 부피는 얼마인가?
튜브에 넣을 산의 부피는 정확히 얼마인가? (액체 가수분해에 한해)
이 단계에서 내부 표준물질을 사용한다면 그 양은 얼마인가?
이어지는 섹션에서는 위 질문에 대한 답을 구하는 방법과 계산 예시를 설명합니다.

2.1.1 사전 고려사항
샘플이 제한적인 경우를 제외하고 오염의 영향을 최대한 줄이기 위해서는 가수분해 물질에 단백질이 2~25µg 포함되어야 합니다. 가수분해 방법과 무관하게 20µg을 추천합니다.

◾샘플에 초과량의 고체 물질이 있으면 안 됩니다. 증기상 가수분해를 간섭하기 때문입니다.
◾샘플 안에 단백질 외의 다른 고체 물질이 있다면 산 부피 당 고체의 농도를 계산하여 그 중량을 단백질에 더해야 합니다.
◾가수분해에서 산의 순농도는 6N을 넘지 않아야 합니다.
◾외부 표준물질보다는 내부 표준물질(예: Nva [norvaline])의 사용을 권장합니다.
◾내부 표준물질은 가수분해가 진행되기 전에 추가해야 합니다. 필요 시 샘플 전처리 단계에서 넣거나 산에 추가한 후 가수분해 튜브에 넣어도 됩니다. 일반적으로 내부 표준물질의 양은 검량에 사용되는 표준물질의 양에 맞춰 계산합니다.
◾페놀을 가수분해에 사용되는 산에 넣어 산소 제거제 역할을 하게 합니다.

2.1.2 액체 가수분해 전 샘플의 희석(필요 시)
◾10µL 이상의 샘플(희석 여부 불문)을 가수분해 튜브에 넣습니다. 이 부피에 미달하면 용량 불확도 때문에 용인할 수 없는 오류가 발생합니다.
◾가수분해를 할 때에는 또 샘플 무게의 10~100배에 달하는 초과량의 산이 필요합니다. 샘플 농도가 너무 높으면 가수분해가 효과적으로 진행되지 않을 수 있습니다. 아래 예에서는 샘플을 반드시 희석해야 합니다. 액체 가수분해에서는 고체 무게의 약 100배에 달하는 초과량의 산이 있어야 합니다.
◾샘플에서는 완충액의 25배 몰이 되는 초과량의 산이 있어야 합니다. 3개의 적정 가능한 그룹에 해당하는 3으로 인산 완충액의 몰을 곱합니다.
◾가수분해의 총 부피는 가수분해 튜브 또는 용기 총용량의 50%를 넘지 않아야 합니다. 6 x 50mm 튜브의 경우 권장 최대 부피는 100µL입니다. 최종 총부피를 구할 때에는 여기에 산과 내부 표준물질의 부피를 추가합니다.

계산 예시: 희석 요건의 결정

150mM NaCl에 5mg/mL의 단백질이 포함되어 있을 때 고체(염 포함) 양과 희석 배수를 계산해 보겠습니다.

1단계: 샘플 속 고체의 총량 계산하기.
첫 단계는 샘플 속 고체의 총량을 계산하는 것입니다. 단백질 농도(µg/µL)에 염의 중량 농도(농도 x MW)를 곱하면 고체의 총량이 얻어집니다.


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2단계: 20µg 목표를 달성하기 위한 희석 비율 계산하기.
다음 단계는 (20µL 속) 단백질 20µg 목표에 필요한 희석 비율을 계산하는 것입니다. 원하는 양/부피에 샘플의 역 농도를 곱하면 됩니다. 계산 결과, 위 샘플에 필요한 희석 비는 1:5입니다.
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2.1.3 가수분해 튜브에 할당할 샘플의 부피
가수분해에서 권장하는 총 부피는 (6 x 50mm 튜브 사용 시) 100µL입니다. 이때 샘플의 부피는 10~20µL입니다. 이 샘플 부피는 희석 여부를 불문하고 가수분해의 유형에 따라 달라지며 다음 가이드라인을 따릅니다.

◾증기상 가수분해: 가수분해 튜브 바닥에서 샘플을 박막으로 진공 건조시킵니다.
◾액체상 가수분해: 적정량을 넣어 가수분해 튜브 안에서 단백질을 2µg 이상 가수분해하거나 더 큰 샘플량(단백질 최대 25µg)에서 충분한 0.1N HCl로 재용매화하여 (가급적 10µL에 든) 단백질 약 0.2µg을 전달해 가수분해합니다.
다시 한 번 강조하지만, 샘플 분취량 중 단백질 함량이 적을 수록 오염이 발생할 가능성이 높아집니다.

2.1.4 가수분해에 추가할 산의 부피
가수분해에 추가되는 산의 부피는 중요합니다. 액체상 가수분해에서는 특히 더 그렇습니다. 산 부피의 가이드라인은 다음과 같습니다. 예도 한 가지 제시되어 있습니다.

◾증기상 가수분해
◾0.1~0.5% 페놀이 포함된 6N HCl 200µL을 가수분해 용기 바닥에 넣습니다. (상용 가수분해 워크스테이션을 이용할 경우 업체에서 권장하는 부피를 넣습니다. 추가 정보는 섹션 4와 5를 참조하십시오.)
◾액체상 가수분해(아래 예 참조):
◾최종 산 농도(페놀 포함)는 6N이어야 합니다.
◾산의 몰 양이 완충액을 중화할 만큼 충분히 과량(최대 25배)이어야 합니다.
◾총 고체 대비 산의 중량이 충분히 과량(최대 100배)이어야 합니다. 이 추정 값에 샘플 매트릭스와 기타 고체, 그리고 단백질의 중량을 추가해야 힙니다.

계산 예시: 액체 가수분해에 추가할 산의 부피를 측정합니다.

위 가이드라인에 따르면, 가수분해에 추가할 산의 최소량은 완충액 농도의 25배, 샘플의 중량의 100배를 초과해야 합니다. 따라서 필요한 산의 부피를 구하기 위해서는 다음을 계산해야 합니다.

1.존재하는 완충액의 양
2.샘플 속 완충액을 중화하는 데 필요한 산의 양(25배)
3.산의 양을 부피로 변환
4.샘플 속 고체 총량
5.샘플 대비 목표 초과량의 산(100배)을 제공하기 위해 필요한 산의 최소량
6.산의 양을 부피로 변환
7. 필요한 산의 총량(중화와 초과량의 합)

2mM Na/K2PO4에 포함된 2.1mg/mL 단백질:

1단계: 각 튜브에 포함된 완충액의 양을 계산합니다.
각 튜브에 포함된 완충액의 양은 완충액 몰 농도에 적정 가능 그룹의 수(인산염 완충액의 경우 3)를 곱한 후 투여된 샘플(여기서는 10µL)의 총 부피로 조정하여 계산합니다.


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각 튜브에는 60 nmol의 완충액이 들어 있습니다.

2단계: 완충액의 25배에 달하는 필요한 초과량 산의 양을 계산합니다.
완충액의 양에 25를 곱하여 25배 초과량을 계산합니다.
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이 샘플의 경우 완충액을 효과적으로 중화하기 위해 필요한 부피는 0.25µL입니다.

4단계: 각 튜브에 포함된 고체 총량(단백질 + 완충액)을 계산합니다.
샘플 대비 100배 산 초과량에 도달하기 위해서는 샘플에 포함된 고체의 총량을 계산해야 합니다. 고체 총량은 단백질에 완충액을 더하고 기타 존재하는 물질을 더해 구합니다. 이 경우 샘플은 정제 단백질입니다.

단백질 농도(µg/µL)에 염의 중량 농도(농도 x MW)를 곱하면 고체의 총량이 나옵니다.
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이 샘플 속 고체 총량은 24.9µg입니다.

5단계: 100배 초과량의 산을 얻기 위해 튜브에 있는 HCl의 총량을 계산합니다.
100배 목표 초과량의 산을 구하려면 고체 총량에 100을 곱하면 됩니다.
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6단계: 산의 초과량을 6N HCl의 부피로 변환해 각 튜브의 산 초과량 부피를 계산합니다.
마지막으로 중량 초과량을 각 튜브에 추가할 6M HCl의 부피로 변환합니다. 산의 몰당 중량에 산의 몰 농도를 곱하면 됩니다.
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이 경우 11.4µL의 6M HCl은 샘플 대비 산의 100배 초과량이 됩니다.

7단계: 각 튜브에 추가할 6N HCl의 최종 부피를 계산합니다(3단계 + 6단계).
각 튜브에 추가할 산의 최종 부피는 샘플 완충액을 중화하고 100배 초과량을 실현하는 데 필요한 부피를 모두 합한 것이 됩니다.
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유효한 가수분해를 위해서는 11.65µL의 6M HCl이 필요합니다. 이 부피는 정확히 전달 가능한 부피로 반올림해도 됩니다.

2.1.5 내부 표준물질(IS)
샘플 속 아미노산별 가수분해의 편차를 보상하는 가장 좋은 방법은 내부 표준물질(IS)을 이용하는 것입니다. 내부 표준물질로 많이 사용되는 것은 노르발린(Nva)입니다.

내부 표준물질 이용 시:

◾샘플 안에서 전처리하여 샘플과 함께 투여할 수 있습니다.
◾샘플과 별개로 추가해도 됩니다.
◾산 안에서 전처리하여 산과 함께 투여할 수 있습니다.
◾기기에서 측정한 주입 부피 1µL이 컬럼에서도 샘플과 같은 양이 전달되도록 내부 표준물질을 전처리해야 합니다.

시작 샘플에 필요한 IS의 양을 구할 때에는 샘플에 필요한 IS의 양에서부터 역으로 계산합니다. 이 계산에서는 반드시 유도체화 단계를 고려해야 합니다.

계산 예시: 샘플의 내부 표준물질의 양 측정

1단계: 튜브별로 필요한 IS 총량을 측정합니다.
IS 총량은 역순으로 구합니다. 즉, 최종 샘플에 필요한 IS의 양과 유도체화 희석 배수, 가수분해 튜브에 포함된 재용매화 샘플을 곱하는 것입니다. 이 예에서는 최종 유도체화 샘플에 25 pmol의 IS가 필요합니다. 이때 샘플은 유도체화 중에 10배로 희석하고 샘플은 유도체화 전에 5배 희석해야 합니다. 그러므로
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이것은 이 가수분해 샘플에 1250 pmol의 IS가 필요하다는 뜻이 됩니다.

2단계: IS의 몰 농도를 중량으로 변환합니다.
제시된 MW(mg/mol)로 µL에서 mL로 변환하면 샘플 1mL당 0.14mg의 IS가 필요함을 알 수 있습니다.
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2.1.6 증기상 산의 가수분해
입자 물질이 거의 또는 전혀 들어 있지 않은 비교적 순수한 단백질 또는 펩타이드 샘플에는 증기상 가수분해를 권장합니다. 감도가 제일 높은 방식이기 때문입니다. 이 가수분해 방식에는 독립형 자동 가수분해 워크스테이션이 좋습니다. 이 절차에서 필요한 진공 컨트롤과 온도 유지, 질소 플러시, 샘플 건조는 섹션 4의 Eldex 가수분해 워크스테이션 등의 자동화 시스템으로 수행할 때 가장 이상적인 결과가 얻어집니다.

시약:

◾부피 기준 1% 페놀이 들어 있는 6N HCl
◾질소(사전 정제 등급)
◾드라이아이스

참고: 시약에 관해 더 자세한 사항은 가수분해 워크스테이션의 사용 설명서를 참조하십시오.

절차(자동 워크스테이션 이용 시):

1. 단백질 0.5~20µg이 들어 있는 분량을 6 x 50mm 가수분해 튜브에 넣어 건조합니다.
2. 0.5% 페놀이 들어 있는 정비점(constant-boiling) HCl 200µL를 진공 바이알 바닥에 넣습니다(아래 팁 참조).
3. 세 가지 진공-질소 플러싱을 번갈아 실시한 후 진공 상태에서 바이알을 밀봉합니다.
4. 24시간 동안 112~116°C에서 가수분해합니다.
5. 바이알을 식힙니다. 실험실 티슈로 튜브 표면에 있는 여분의 HCl을 닦아냅니다. 진공 상태에서 건조합니다.

팁:

◾결정질 페놀을 이용하고 결정 하나(약 0.5mg)를 바이알 바닥에 넣습니다. 결정질 페놀은 액화 페놀보다 깨끗하고 더 안정적입니다.
◾샘플과 내부 표준물질을 피펫으로 조심스럽게 튜브 바닥으로 옮깁니다. 정확하고 쉽게 옮기고 싶다면 실린지를 이용하십시오.
◾줄이나 끝에 다이아몬드가 달린 연필로 관에 표시를 해도 됩니다.
◾튜브에 HCl 방울이 들어가지 않게 합니다. 진공 바이알 안에서는 튜브를 똑바로 세워 둡니다. 튜브가 10~12개를 초과하지 않으면 빈 튜브를 넣어 서로 지지하게 합니다. 냉각시킬 때에는 바이알을 조금 비스듬히 둬도 좋습니다.

참고: 가수분해 후에는 흔히 HCl에 갈색 빛이 돕니다. 그건 페놀 때문에 그렇습니다. 에탄올이나 아세톤이면 바이알과 상단부의 탈색을 효과적으로 제거할 수 있습니다.

주의: 가수분해 문제와 유도체화 문제는 구별하기 어려울 수도 있습니다.

2.1.7 액체상 산의 가수분해
액체상 가수분해는 샘플이 복잡할 때 이용합니다. 이 경우 미립자나 기타 이물질이 있어서 증기상 프로세스를 간섭하기도 합니다. 이 방식은 전체적으로 감도가 낮다는 평가를 받고 있지만 면밀하게 또 정밀하게 실시한다면 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.

◾이 방법에 필요한 장치와 시약은 다음과 같습니다.
◾분석 저울
◾설정 온도를 ±0.1°C로 유지할 수 있는 오븐 또는 히팅 블록
◾볼텍스 믹서
◾홀 피펫
◾조절식 마이크로피펫
◾마개가 있는 가수분해 튜브, 6 x 50mm 권장
◾세척용 질소 소스
◾6N HCl

절차:

시작하기 전에

약 20mg 단백질에 해당하는 샘플을 0.1mg 오차로 계량해 가수분해 튜브에 넣거나 희석된 샘플(섹션 2.1.3, 2.1.4에 따라 계산)을 튜브로 옮깁니다. 대체로 총 부피는 10µL가 됩니다. 혼합합니다.

1. 내부 표준물질을 섹션 2.1.5에 따라 계산하여 정확한 부피로 가수분해 튜브에 넣습니다. 혼합합니다.
2. 6N HCl 초과량(섹션 2.1.4의 3단계)을 추가하고 혼합한 다음 질소로 30초 동안 퍼지합니다. 즉시 마개를 닫습니다.
3. 오븐에 넣고 110°C에서 24시간 가열합니다. (이 파라미터들은 대상 단백질과 아미노산에 대해 시간 경과에 따른 연구를 하여 얻은 결과여야 합니다.)
4. 오븐에서 꺼내 식힙니다.
5. 이로써 유도체화 단계를 위한 샘플 전처리가 끝났습니다.

2.1.8 산성 가수분해 문제 해결
가수분해가 제대로 되지 않으면 여러 가지 아미노산이 영향을 받습니다. 예:

◾메티오닌(Met)과 티로신(Tyr)의 낮은 수율은 가수분해 절차의 불량을 보여주는 대표적인 지표입니다. 여기서 불량이란 HCl이 불순하거나 산소의 제거가 충분하지 않았다는 뜻입니다. 어느 것이 문제가 됐든 결과적으로 염소가 형성되고 이어서 Tyr이 염소화됩니다.
◾소수성 아미노산(Ile, Leu, Val 등)의 수율이 낮다면 가수분해가 불완전하다는 의미일 수도 있습니다. 원인은 낮은 오븐 온도 또는 가수분해 시간 부족(특히 높은 온도에서 빠르게 가수분해 실시) 또는 질소로 퍼지한 후 과도한 배출(evacuation)로 인한 HCl의 손실입니다(이것은 특정 샘플에 한정된 문제일 수도 있음. lle-Val-Leu 등 시퀀스 중에는 가수분해에 대한 저항력이 지극히 큰 것도 있음). 튜브 안에서 액체 HCl이 보이는지 확인한 후에 오븐에 넣습니다. HCl이 너무 많아도 문제가 됩니다. 샘플에서 액체가 응결하여 갈색 잔류물이 생기고 Tyr과 Met가 손실되며 피크가 이탈(stray)하기 때문입니다.
◾기체상 가수분해 워크스테이션이 없다면 가수분해용 시설이 제대로 설치되어 있는지 확인해야 합니다. 가수분해 바이알 전체가 오븐 안에 들어가 있어야 합니다. 바이알의 아랫부분 절반만 감싸는 히팅 블록을 이용하면 꼭대기에서 액체 HCl이 응결되어 가수분해의 효과가 떨어집니다.
2.2 트립토판(Trp)의 분석
단백질과 펩타이드에 포함된 트립토판을 분석할 때 6N HCl을 이용한 정상 가수분해 조건을 적용하면 트립토판이 불안정해 과정이 복잡해집니다. 이 경우 다음과 같이 다른 가수분해 절차를 적용해 분석에 필요한 인텍 트립토판(Trp)을 만들어도 됩니다.

◾ 술폰산 가수분해(예: 메탄 술폰산과 p-톨루엔 술폰산)
◾ 염기 가수분해와 HCl에서 B-메르캅토에탄올(BME) 또는 티오글리콜산 등의 티올 시약 이용

2.2.1 트립토판 분석 시 메탄술폰산(MSA) 가수분해
MSA 시약은 6 x 50mm 샘플 튜브(액체상 가수분해)에 직접 넣어야 합니다. 휘발성이 없는 산이기 때문입니다. 가수분해 후에 메탄올을 넣고 중화시키면 트립토판의 결과가 좋게 나오며 후속 유도체화 프로세스에도 간섭이 일어나지 않습니다. 그림 2에 MSA와 단백질의 반응이 나와 있습니다.
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그림 2. Trp 분석의 MSA 가수분해.
참고: 이 절차는 Cys와 Met 계산에 사용할 수도 있습니다.Cys를 Cya로, Met를 메티오닌 술폰으로 변환합니다.

참고: Tyr과 Trp은 예로부터 Cys와 Met 분석에 사용되어 왔던 퍼포믹산 산화 절차에서는 안정적이지 않습니다.

2.2.1.1 장치와 시약
◾0.2%(w/v) 트립타민 HCl이 포함된 4M MSA
◾초순수
◾메탄올-물-트라이에틸아민, 2:2:1
◾가수분해 튜브, 6 x 50mm
◾진공 건조 장치
◾수조 또는 히팅 블록

2.2.1.2 절차
1. 0.2%(w/v) 트립타민 HCl이 포함된 4M MSA 20µL를 건조 샘플이 들어 있는 6 x 50mm 샘플 튜브 각각에 넣습니다.
2. 반응 바이알에 물 I00µL를 넣습니다.
3. 가수분해에 앞서 밀봉합니다.
4. 20~24시간 동안 110°C에서 가수분해합니다.
5. 식힌 후 바이알을 열고 22µL의 4M KOH(중화하기에 충분한 양)를 각 샘플 튜브에 넣습니다.
6. 진공 상태에서 건조합니다.
7. 이로써 유도체화를 위한 샘플 준비가 끝났습니다.

팁:

대조 blank 샘플로 간섭물질이 있는지 검사합니다.

◾신선한 순수 MSA를 이용합니다.
◾Tyr이나 Val을 간섭하는 물질 중에는 시판되는 산에 첨가물로 들어가는 트립타민에서 유래하는 것도 있습니다. 이 첨가물이 없는 MSA를 사용하면 그런 문제가 발생하지 않습니다.
◾신선한 KOH(또는 실험실에 있는 NaOH가 더 깨끗하다면 NaOH)를 사용합니다. 이 염기가 산을 제대로 중화하는지 시험 샘플로 시험합니다. 염기의 초과량이 최소가 되게끔 염기를 추가합니다.
◾H20에서 2.5µmol/mL의 Trp 표준물질을 만듭니다. 냉장고에 보관합니다. 검량 용도로 Trp 표준물질을 H 표준물질과 1:1로 혼합합니다.

유의사항:

◾Tyr과 Val에 간섭을 일으킬 수도 있습니다. 원인은 알려져 있지 않습니다. (Tyr 가수분해에는 HCl을 사용하는 것이 좋습니다.)
◾Met 수율이 낮은 것은 가수분해 조건과 관련이 있습니다.
◾Trp와 Met의 수율은 분석 절차가 아니라 가수분해 프로세스 때문에 직선성을 나타내지 않습니다. 가수분해되는 양이 줄어들면 수율도 떨어집니다. Met의 결과는 더 현저합니다.
◾결과적으로 Arg의 재현성이 떨어집니다. 원인은 미상입니다.

2.2.2 트립토판 분석 시 알칼리성 가수분해
트립토판의 산성 가수분해에서 안정성 문제가 발생할 경우 대안으로 염기를 이용한 단백질 가수분해를 할 수 있습니다.

2.2.2.1 장치와 시약
◾NaOH
◾아세트산(Acetic acid)
◾초순수
◾가수분해 튜브, 6 x 50mm
◾진공 건조 장치
◾수조 또는 히팅 블록

2.2.2.2 염기성 가수분해 절차
1. 규산염이 형성되어 용해되거나 유도체화에 문제가 생기지 않도록 플라스틱(예: 테플론) 튜브를 사용해야 할 수 있습니다.
2. 위 MSA 절차와 같이 가수분해 튜브에 20µL의 신선한 4M NaOH를 직접 넣습니다.
3. 튜브를 밀봉하고 112°C에서 16시간 동안 가열합니다.
4. 식힌 후 초과량의 아세트산으로 중화합니다.
5. 이로써 유도체화를 위한 샘플 준비가 끝났습니다.
6. Blank를 실행하여 오염 레벨을 측정합니다.
7. 표준물질과 알려져 있는 샘플로 Method를 검증합니다.

2.3. 황 함유 아미노산(시스테인, 시스틴, 메티오닌) 분석을 위한 가수분해법
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그림 3. 황이 들어 있는 아미노산.
단백질 샘플에 포함된 시스테인(Cys)을 정량 분석할 때 표준 산성 가수분해 조건에서는 시스테인이 불안정해 과정이 복잡해집니다. 그러나 Trp과는 다르게 만족스럽게 이용할 만한 산성 또는 염기성 가수분해가 달리 없습니다. Cys를 분석할 때 일반적으로 사용되는 두 가지 방법에서는 시스테인을 더 안정적인 유도체로 변환합니다. 첫 번째 절차는 설프히드릴기를 알킬화하는 것이고 두 번째 절차는 산 안정성이 좋은 술폰산이나 시스테인산 또는 시아누르산(Cya)으로 산화하는 것입니다.

경고: Cys 분석이 복잡한 또 한 가지 이유는 이것이 상당 부분 이합체, 즉 시스틴(Cys2) 상태로 존재한다는 것입니다. 시스틴은 알킬화 전에 시스테인으로 환원을 시켜야 합니다.

이 절차는 표준 산성 가수분해 절차 전에 반드시 실시해야 합니다.

2.3.1 시스테인, 시스틴, 메티오닌의 탈아미드화를 위한 퍼포믹산 산화
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그림 4. 시스틴과 시스테인을 시스텐인산으로 퍼포믹산 산화.
퍼포믹산은 강력한 산화 시약으로 (그림 4와 같이) 시스테인(Cys)과 시스틴(Cys2)을 시스테인산(Cya)으로 정량 변환하는 역할을 합니다. 문헌에는 여러 가지 조건과 절차에서 이 시약을 이용하는 방법이 많이 나와 있습니다. 다음은 Tarr, G.E., 1986에서 발췌한 것입니다.

참고: 이 절차를 따랐을 때 시스테인과 메티오닌의 결과가 가장 정확합니다.

2.3.1.1 장치와 시약
◾진공 건조 장치
◾6 x 50mm 가수분해 튜브(마개 포함)
◾초순수 포름산
◾초순수 과산화수소
◾분석 저울
◾마이크로피펫

2.3.1.2 절차
1. 샘플(0.1~10µg 단백질 또는 50~2000 pmol 펩타이드)을 6 x 50mm 가수분해 튜브에서 진공 건조합니다.
2. 97% 포름산 19부피를 과산화수소 1부피와 혼합합니다. 덮개를 덮은 후 22°C에서 한 시간 동안 세워 둡니다.
3. 이 시약 10µL를 건조된 샘플에 넣고 22°C에서 30분간 세워 둡니다. 이어서 진공 건조합니다.
4. 섹션 1.1과 같이 표준 6M HCl 절차에 따라 가수분해합니다.
참고: Tyr과 Trp은 이 산화 절차에서 안정적이지 않습니다.

2.3.2 시스틴의 알킬화
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그림 5. 시스틴과 시스테인의 알킬화.
알킬화를 진행하는 절차는 퍼포믹산 산화보다 선택성이 우수하고 다른 아미노산의 변화가 거의 또는 전혀 없습니다. 따라서 완전 단백질을 분석할 때, 또한 펩타이드 매핑처럼 Cys 변형을 동반할 수도 있는 절차에 적합합니다.

이 방법에서는 4-비닐피리딘을 예로 들어 알킬화를 소개합니다. 아래에서 설명하는 일반 절차는 알킬화제마다 변형해도 됩니다. 원칙적으로는 샘플에 환원 시약을 충분히 넣어 시스틴(Cys2)을 시스테인(Cys)으로 변환해야 합니다. 그다음에는 (그림 5와 같이) 초과량의 알킬화 시약을 환원된 샘플에 넣습니다.

2.3.2.1 장치와 시약
◾진공 건조기, 질소 건조 소스 또는 동결 건조기
◾재밀봉이 가능한 바이알
◾분석 저울
◾pH 측정기
◾마이크로피펫
◾표준물질로 사용할 피리딜에틸 시스테인(PEC)
◾구아니디늄 HCl(Gu-HCl)
◾디티오트레이톨(DTT)
◾4-비닐피리딘(4-VP)
◾N-아세트산 에틸모르폴리늄
◾초순수 아세트산
◾아미노산 표준물질(p/n: WAT088122)

2.3.2.2 시약 전처리: 0.5M, pH 8.3
1. N-에틸모르폴리늄 6.4mL에 물을 넣어 부피를 100mL로 조정합니다.
2. 아세트산을 사용해 pH 8.3으로 적정합니다.

2.3.2.3 절차
단백질 또는 펩타이드 1~1000 nmol에는 아래 절차를 적용해도 됩니다.

1. 샘플을 밀봉 가능한 바이알에 넣고 진공 건조하거나 N2 또는 동결 건조합니다.
2. 1mL 완충액에 샘플을 용해합니다.
3. 1g의 Gu-HCl을 넣습니다. 혼합합니다.
4. 4mg의 DDT를 넣습니다. 혼합합니다.
5. N2로 샘플을 블랭킷하고 단단히 밀봉한 후 상온에서 4시간 동안 인큐베이션합니다.
6. 8µL의 4-Vp를 넣고 N2로 블랭킷한 후 밀봉하고 상온에서 4~16시간 인큐베이션합니다.
7. 3mL의 물을 추가합니다.
8. 염분을 제거합니다.
9. 이제 산성 가수분해를 해도 됩니다.

참고: 총 반응 부피는 완충액을 0.25mL로, Gu-HCl을 250mg로, DTT를 1mg로, 4-VP를 2µL로 줄여 스케일 다운할 수 있습니다. 최대 250 pmol의 샘플에 대해 충분합니다. 알킬화 후 750µL의 H20로 희석하고 처리합니다.

2.3.2.4 후속 유도체화를 위한 검량 표준물질(옵션)
1. 피리딜에틸 시스테인(PEC) 용액 2.5mN을 만듭니다.
2. 200µL의 아미노산 표준물질을 200µL에 추가합니다.
3. 합쳐진 PEC 검량 혼합물 10µL을 유도체화합니다.
4. 100µL에서 재용매화하고 4µL을 주입해 250 pmol 수준에서 검량합니다.
주의: 4-VP 8µL은 약 74µmol입니다. 위 절차에서 4-VP 대신 다른 알킬화 시약(예: 요오도 아세트산)을 사용해도 됩니다. 단, 시약 농도는 같아야 합니다.