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Q&A

2022.08.18

아미노산 가수분해와 분석 종합 가이드

Waters AccQ•Tag 케미스트리를 이용한 아미노산 유도체화

6.1 서문
액체 크로마토그래피와 광학 검출로 아미노산을 분석하기 위해서는 샘플 전처리가 추가로 필요합니다. 아미노산에는 발색단이 없어 이러한 기법으로 검출되지 않기 때문입니다. 따라서 아미노산 분석 시 가수분해 후에는 유도체화가 뒤따릅니다. 이번 섹션에서는 Waters AccQ•Tag 케미스트리를 이용하여 단백질 또는 펩타이드 가수 분해물의 유도체화를 진행하는 전처리 과정을 설명합니다.

가수분해된 샘플을 알맞게 또 안정적으로 유도체화하기 위해서는 다음 사항을 반드시 고려해야 합니다.

◾미립자 제거
◾유도체화할 샘플 질량 측정
◾샘플 중화의 필요성 판단
◾샘플 질량을 고려해 초과량의 유도체화 시약 사용
아래 설명은 사정상 축약한 것입니다. AccQ•Tag 유도체화 케미스트리에 관하여 자세한 사항과 지침은 www.waters.com/AAA를 참조하십시오.


6.2 미립자 물질 제거
미립자나 부유 지질이 다량으로 포함되어 있다면 원심분리가 필요할 수도 있습니다. 원심분리를 하면 유도체화를 위한 투명 가수분해물을 분취하기가 더 수월합니다.

사료 분석 가수분해물과 같이 샘플의 부피가 크다면 미립자를 필터링하는 것만으로도 충분합니다. 단, 필터 재질에 따라 샘플 회수율이 달라질 수도 있으니 주의해야 합니다. 편향되지 않은 결과를 얻기 위해서는 이 부분을 고려하여 처리해야 합니다. 이때 사용할 필터의 성능에 관해서는 필터 제조사에 문의하십시오.

6.3 Waters AccQ•Tag 케미스트리를 이용한 유도체화
AccQ•Tag Method란 가수분해된 펩타이드와 단백질의 아미노산 분석을 할 때 이용하는 프리 컬럼 유도체화 기법입니다. AccQ•Tag Method의 주요 특징:

◾Waters AccQ•Tag Ultra 또는 AccQ•Fluor Reagent를 이용하여 아미노산을 유도체화
◾그래디언트 기반 역상 HPLC 또는 UPLC를 이용하여 유도체를 분리
◾외부 아미노산 표준물질과 광학 검출을 이용하여 유도체를 정확하게 정량분석

6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate(AQC) 시약은 1차 아민, 2차 아민 모두와 반응합니다. 초과량의 AQC 시약은 물과 반응해 6-aminoquinoline(AMQ)을 형성합니다. AMQ는 초과량의 AQC 시약과 천천히 반응해 이중 요소(bis urea)를 형성합니다. 이러한 부산물은 펩타이드나 단백질 가수분해물에 포함된 아미노산을 분리, 확인, 정량분석할 때 방해 요인으로 작용하지는 않습니다. 유도체는 며칠이 지나도 안정적이므로 필요 시 일괄(batch) 처리나 반복 분석도 가능합니다.

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그림 10. 일차와 이차 아미노산 유도체화 후 AccQ•Tag 반응 도해
오랫동안 AccQ•Tag 유도체화 반응의 정확도를 확보하려는 연구가 폭넓게 진행되어 왔습니다. 아미노산의 완전한 유도체화를 위해 화학 반응은 초과량 몰의 유도체화 시약과 염기성 pH(8-10) 조건에서 진행되어야 합니다. 이 핵심 요소를 충족하기 위한 여러 가지 방법이 개발되었습니다.

6.3.1 AccQ•Tag 유도체화를 위한 샘플량 측정
반응이 진행될 때 일반적으로 샘플을 10배 희석하여 총 유도체화 부피 100µL당 1µL를 분취해 컬럼에 주입합니다. 유도체화를 할 때 아미노산 함량이 항상 일정하게 유지되는 것이 아니므로 검출 또는 정량 한계에 도달할 최소량 아미노산을 확보하기 위해 충분한 샘플량을 갖춰야 합니다. 정확한 정량분석을 달성하기 위해, 최소량 아미노산에서 최소 1 pmol의 유도체를 얻기 충분한 최대 주입 부피 1µL를 사용할 것을 권장합니다. 필요 샘플량을 계산하는 방법은 다음과 같습니다.

계산 예시:
1.0mg/mL 단백질의 샘플 농도:
최소량 아미노산을 얻기 위한 필요 샘플량을 추정합니다. 이 예에서는 컬럼에 1 pmol 아미노산을 전달하기 위해 0.03mg/mL의 샘플 농도가 필요하다고 가정하겠습니다.

1단계: 최소량 아미노산의 근사 몰 농도를 계산합니다.
mg를 mol로 변환합니다(단백질 속 아미노산 잔류물의 평균 분자량은 110).
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그러면 샘플 속 최소량 아미노산의 추정 농도가 얻어집니다.

2단계: 컬럼에 1 pmol의 최소량 아미노산을 전달하기 위해 필요한 희석 배수를 결정합니다.


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계산한 결과 27배(10 ÷ 0.37 = 27)입니다.

유도체화를 진행하기 전에 가수분해물을 27배 희석해야 합니다. 예를 들어 샘플 가수분해물 5µL를 0.1N HCl 135µL로 희석하면 이 목표 값을 달성할 수 있습니다.

마지막으로 위 희석액을 10µL 분취하여 유도체화 바이알에 옮기면 됩니다.

6.3.2 AccQ•Tag 유도체화를 위한 중화
가수분해물에 포함된 아미노산을 AccQ•Tag 시약으로 충분하게 유도체화하기 위해서는 샘플을 pH 8.2~10.1 정도로 버퍼링해야 합니다. 산성 수화물이 적절하게 중화되지 않고 pH가 8.2 아래로 떨어지면 유도체화가 충분히 진행되지 않을 수 있습니다. 아미노산에 대한 pH의 영향은 아미노산별로 상이합니다. 글루타민산, 알라닌 등의 산성 아미노산은 세린이나 페닐알라닌보다 pH에 의한 영향을 더 쉽게 받습니다. 오리지널 샘플 속 아미노산 전부를 정확히 정량하기 위해서는 pH가 대단히 중요합니다.

◾아미노산을 0.1N HCl에 용해시킬 경우 pH 조정 없이 10–20µL 샘플을 유도체화 혼합물에 직접 넣을 수 있습니다. 주의: 아래에 설명한 바와 같이 초과량의 유도체화 시약을 확보하는 것이 중요합니다.
◾아미노산 용액의 산 농도가 높을 경우(>0.1N HCl) 동일 농도와 부피의 수산화나트륨으로 중화시켜야 합니다. 이러한 중화 작업은 벌크 부피로 추가해도 되고 유도체화 단계에 통합해도 됩니다.
◾필요한 붕산염 완충액 양을 NaOH로 대체하여 샘플 속 HCl를 중화합니다.
◾유도체화 반응 바이알 혼합물에 xM NaOH 10µL와 붕산염 60µL을 넣습니다. (xN HCl에 용해된) AA 샘플 10µL를 넣습니다. AccQ•Fluor 시약 20µL로 유도체화합니다.
◾중화가 적절하게 이루어졌는지 의심스럽다면 시험 샘플을 만들어 일회용 pH 스트립으로 최종 pH를 확인해 봐도 좋습니다.
경고: 유도체화 시약을 넣었을 때 샘플이 밝은 노란색으로 변한다면, 샘플의 pH가 너무 낮음을 의미합니다. 이때 NaOH로 중화하십시오.

계산 예시:
중화에 필요한 NaOH의 양을 계산하는 방법은 다음과 같습니다.
위 예에서 6N HCl에 용해된 1.0mg/mL 단백질 샘플은 27배로 희석해야 샘플에서 초과량의 유도체화 시약을 확보할 수 있으며 다음 계산 방식을 적용 가능합니다.

1단계: 희석 후 샘플의 최종 산 농도를 계산합니다.
샘플의 산 농도를 mol에서 µmol로 변환합니다.


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희석된 샘플 속 산의 최종 농도를 구합니다.

참고: 샘플 가수분해물 5µL를 0.1N HCl 135µL로 희석하면 이 목표 값을 달성할 수 있습니다.

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2단계: 유도체화를 위해 완충액에 추가할 염기(NaOH)의 양을 구합니다.
유도체화별로 필요한 NaOH의 총 양은 0.31M입니다.

유도체화를 위해 추가할 붕산염 완충액 총 양은 70µL이므로 두 가지 중화법이 있습니다.

유도체화를 할 때마다 0.31M NaOH 10µL와 완충액 60µL를 넣습니다.

별도 바이알에서 붕산염 완충액 600µL와 0.31M NaOH 100µL를 섞습니다. 혼합합니다. 각 샘플에 이 혼합물 70µL + 샘플 10µL + AccQ•Tag 유도체화 시약 20µL를 넣습니다.

6.3.3 AccQ•Tag 유도체화 수행 시 초과량의 유도체화 시약이 확보되었는지 확인
모든 아미노산을 충분하게 유도체화하기 위해서는 반응 시 4–6배 초과량 몰의 AccQ•Tag 유도체화 시약이 필요합니다. 시약이 부족하면 상대적으로 민감한 일부 아미노산이 완전히 유도체화 되지 않습니다. 아미노산별로 유도체화의 비율은 아미노산의 화학적 속성에 따라 다릅니다. 예를 들어, 알라닌은 초과량 몰의 AccQ•Tag 시약이 불충분할 경우 회수율이 크게 영향을 받지만 페닐알라닌은 별다른 영향을 받지 않습니다.

시약 바이알에 추가할 샘플의 양을 구하기 위해서는 각 바이알에 들어 있는 시약의 양을 알아야 합니다. 표준 AccQ•Tag 시약 바이알에는 시약이 3~4mg의 시약이 포함되어 있으며, 이것은 약 10–14 µmol에 해당합니다. 이 시약은 아세토니트릴 1mL에 용해되고 유도체화 반응액 100µL당 20µL가 사용되므로, 각 반응기에는 유도체화 시약이 210~280nmol 들어 있습니다.

각 반응 바이알에는 시약이 210~280nmol 들어 있고 샘플별로 4~6배의 초과량 몰이 필요하므로 각 반응의 아민 총 양이 40~140 nmol보다 적지 않아야 합니다.

계산 예시:
단백질 샘플은 샘플 무게와 아미노산의 평균 무게에 기반해 요구되는 초과량을 추정합니다.

1단계: 스톡 용액의 mg/mL 농도를 아미노산 몰 농도로 변환합니다.
예를 들어, 단백질 농도가 1~mg/ml이고 평균 분자량이 110일 때 샘플 속 단백질의 양은 다음과 같이 계산합니다.


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여기서 MW는 g/mol에서 µg/µmol 단위로 변환합니다.

1mL = 103µL

1mmol = 103µmol = 106nmol

2단계: 각 반응의 아미노산 몰 양을 계산합니다.
몰 농도를 얻은 후 샘플 속 아미노산의 양을 계산합니다.

1단계의 1mg/mL 단백질[섹션 6.3.1에서 27배 희석한 용액(5µL 가수분해물 스톡 용액 + 135µL 완충액)]을 이용하여 희석된 샘플 10µL 속 아미노산 양(nmol)을 다음과 같이 계산합니다.
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3.3nmol은 140nmol 한계보다 훨씬 낮으므로 샘플은 허용 가능한 수준에 있습니다.

6.4 HPLC 기반 아미노산 분석
HPLC AccQ•Tag Method는 1992년 Waters Corporation에서 상용화한 것으로 2006년 출시된 AccQ•Tag Ultra Method에서 사용한 것과 동일한 프리 컬럼 유도체화 단계를 따릅니다. AccQ•Fluor 시약, 즉 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate(AQC)는 간단한 1단계 반응을 통해 1차와 2차 아민을 유도체화하여 매우 안정적인 형광성 부가물을 형성합니다. Waters에서는 사전 패키징된 시약과 여러 가지 문서가 포함된 시스템 패키지 형식으로 AccQ•Tag Method를 제공합니다. AccQ•Tag 케미스트리 패키지에는 단백질과 펩타이드 가수분해물 아미노산을 최대 250회 분석할 수 있는 품목이 들어 있습니다.

AccQ•Tag 유도체화 키트에는 유도체화 시약이 5세트 들어 있습니다. 각 시약 세트에는 다음 각 품목이 한 바이알씩 들어 있습니다.

◾AccQ•Fluor 붕산염 완충액 – 유도체화에서 최적의 pH를 조정하기 위해 샘플에 추가
◾AccQ•Fluor 시약 분말 – 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate. (AQC) 유도체화 시약(높은 안정성을 위해 건조된 상태로 출하)
◾AccQ•Fluor 시약 희석액 – 아세토니트릴, 유도체화 전에 시약을 재용매화하기 위해 사용
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그림 11. Waters AccQ•Tag Method를 이용한 HPLC 기반 아미노산 분석의 대표 크로마토그램
6.5 UPLC 기반 아미노산 분석 솔루션
Waters UPLC 아미노산 분석 솔루션은 턴키 아미노산 분석 용도로 특별 설계되었습니다. Waters ACQUITY UPLC 시스템에 함께 포함된 AccQ•Tag Ultra와 역상 UPLC 컬럼, 용리액, Method를 이용하여 프리 컬럼 유도체화 아미노산을 분리합니다. 강력한 유도체화 케미스트리, 안정적인 크로마토그래픽 베이스라인, 우수한 아미노산 분리능을 통해 정확하고 정밀하며 일관성 있는 정량 결과를 얻을 수 있습니다.

UPLC 아미노산 분석 솔루션의 포함 품목:

◾Waters AccQ•Tag Ultra 케미스트리 소모품(컬럼, 시약, 용리액 등) - 모두 아미노산 분석 용도로 QC 검증 완료
◾Empower 2 Software, 사전 구성된 프로젝트와 Method, 보고서 형식
◾시스템과 응용 수준의 포괄적인 지원 문서

Waters ACQUITY UPLC 시스템은 TUV, PDA 및 형광 검출기, 이 세 가지 광학 검출기를 지원합니다.


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그림 12. Waters UPLC 아미노산 분석 솔루션
6.5.1 여러 가지 샘플 매트릭스에서 정확한 아미노산 분석
UPLC 아미노산 분석 솔루션에는 동일 기기와 케미스트리를 이용하는 Method 두 세트가 들어 있습니다. 하나는 단백질 가수분해물에서 유도체화 된 아미노산에 적합하고, 다른 하나는 세포 배양액이나 발효액 등의 공정 샘플에서 나오는 다량의 유리 아미노산에 적합합니다. 두 Method는 AccQ•Tag Ultra Eluent A의 희석과 분리 컬럼 온도 면에서 차이가 있습니다. pH를 조정하거나 용리액 A 또는 용리액 B의 조성을 변경할 수는 없습니다.

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그림 13. UPLC AccQ•Tag 솔루션의 대표 크로마토그램 (A) UPLC 아미노산 분석 솔루션 가수분해물 Method를 이용한 표준 아미노산의 분리. (B) UPLC 아미노산 분석 솔루션 세포 배양 Method를 이용한 대량 표준 아미노산의 분리. 이동상 또는 조성 수정을 하지 않아도 됩니다.
6.5.2 가수분해 단백질의 아미노산 분석
단백질의 아미노산 분석은 구조 확인의 일부, 그리고 샘플 속 단백질 총 양을 측정하는 용도로 사용될 수 있습니다. 샘플은 분석 전에 가수분해합니다. 구조 분석에서는 아미노산의 몰 비를 시퀀스에서 예상되는 값과 비교합니다.

단백질 양은 아미노산 무게의 합입니다. 이 단백질 농도는 샘플 성분이 일반적인 단백질 분석을 간섭할 때 흡광 계수 계산에 이용됩니다. 각 아미노산의 무게 비중과 총 단백질 질량은 식품과 사료의 영양소 함량을 평가할 때 이용됩니다. Waters UPLC 아미노산 분석 솔루션을 이용하면 이러한 용도에서 안정적인 일상적 분석이 가능합니다.

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그림 14. 순수 단백질 가수분해의 아미노산 분석.
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그림 15. 가수분해된 가금류 먹이의 아미노산 분석